Kromatografi Lapis Tipis


1.      Kromatografi

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas) (Patnaik 2004). Teknik pemisahan ini memanfaatkan interaksi komponen dengan fase diam dan fase gerak serta sifat fisik dan sifat kimia komponen. Berdasarkan fase gerak dan fase diam yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi liquid-solid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud padat dan fase gerak berwujud cair), gas-solid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud padat dan fase gerak berwujud gas), liquid-liquid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud cair dan fase gerak berwujud cair), dan gas-liquid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud padat dan fase gerak berwujud gas) (Harvey 2000).

Berdasarkan interaksi komponen dengan fase diam dan fase gerak, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi adsorpsi (kromatografi dengan teknik penyerapan komponen oleh adsorben tertentu), kromatografi partisi (kromatografi dengan partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam), kromatografi pertukaran ion (kromatografi yang dapat memisahkan senyawa dengan afinitas ion yang berbeda dengan resin penukar ion), dan kromatografi permeasi atau filtrasi (kromatografi berdasarkan perbedaan bobot molekul) (Skoog et al 2002). Berdasarkan bentuk ruang penyangganya, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi planar (kromatografi dengan fase diam terletak pada permukaan datar) yang meliputi kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis serta kromatografi kolom (kromatografi dengan fase diam tertahan pada sebuah kolom) yang meliputi kromatografi manual, high performance liquid chromatography, dan kromatografi gas (Harvey 2000). Percobaan ini hanya melakukan aplikasi kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Prinsip dari kedua aplikasi tersebut adalah dengan meneteskan sampel pada kertas di garis startnya berulang-ulang. Setelah kering, kertas dimasukkan dalam pelarut jenuh dan dibiarkan bergerak menuju garis finish. Kromatografi lapis tipis menggunakan lempeng tipis/ plastik yang dilapisi adsorben sebagai penyangga. Kromatografi kertas menggunakan kertas sebagai penyangga (Rouessac 2007).

2.      Kromatografi Lapis Tipis

TLC (Thin Layer Chromatography) yang biasa disebut Kromatografi lapis tipis (KLT) bersama-sama dengan kromatografi kertas (KKr) dengan berbagai macam variasinya pada umumnya dirujuk sebagai kromatografi planar. Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Settle,1997).

Kromatografi lapis tipis merupakan teknik pemisahan yang banyak digunakan dalam proses pemurnian dan identifikasi senyawa kimia pada tanaman obat. Prinsip KLT adalah pemisahan komponen berdasarkan distribusinya pada fase diam dan fase gerak. Komponen yang memiliki interaksi lebih besar terhadap fase diam akan tertahan lebih lama. Sebaliknya, komponen yang memiliki interaksi lebih besar terhadap fase gerak akan bergerak lebih cepat. Fase diam yang umum digunakan pada KLT adalah silika gel, alumina, kieselguhr, dan selulosa (Adnan 1997).

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat (Mulya,1995).

Dibandingkan dengan HPLC dan GC, TLC mempunyai beberapa keuntungan, yaitu:
  1. KLT memberikan fleksibilitas yang lebih besar, dalam hal memilih fase gerak.
  2. Berbagai macam teknik untuk optimasi pemisahan seperti pengembangan 2 dimensi, pengembangan bertingkat, dan pembaceman penjerap dapat dilakukan pada TLC.
  3. Proses kromatografi dapat diikuti dengan mudah dan daat dihentikan kapan saja.
  4. Semua komponen dalam sampel dapat dideteksi.

Penjerap/Fase diam

Penjerap yang paling sering digunakan pada TLC adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada TLC adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang digunakan untuk pemisahan kiral. Beberapa penjerap TLC serupa dengan penjerap yang digunakan pada HPTLC. Kebanyakan penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur kromatografi, terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengembang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12 % b/b.

Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak. Lempeng fase terbalik jenis ini digunakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid (Adomovic,1997)



Fase Gerak pada KLT

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
  1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
  2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
  3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
  4. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam (Kaelay,2002).

Aplikasi (Penotolan) sampel

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 μl. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda. Berdasarkan pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah disarankan untuk digunakan dan diringkas pada tabel dibawah ini.

Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan.



Pengembangan

a)      Konvensional dan KLT-kinerja tinggi
Pengembangan pelarut biasanya dilakukan dengan cara menaik (ascending), yang mana ujung bawah lempeng dicelupkan ke dalam pelarut pengembang. Untuk menghasilkan reprodusibilitas kromatografi yang baik, wadah fase gerak (chamber) harus dijenuhkan dengan uap fase gerak. Jarak pengembangan fasegerak biasanya kurang lebih 10-15 cm; akan tetapi beberapa ahli kromatografi memilih mengembangkan lempeng pada jarak 15 – 20 cm. Untuk lempeng KLT-kinerja tinggi (HPTLC), yang mempunyai ukuran partikel lebih kecil, maka pengembangan lempeng dilakukan ada jarak antara 3- 6 cm.

b)      Pengembangan 2 dimensi
KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.

c)      Pengembangan Kontinyu
Pengembangan kontinyu (pengembangan terus menerus) dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak secara terus-menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah (biasanya alas tangki) melalui suatu lapisan dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung lapisan.

d)      Pengembangan gradient
Pengembangan ini dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak yang berbeda-beda. Lempeng yang berisi analit dapat dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak tertentu lalu komponen fase gerak selanjutnya ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam bejana dan diaduk sampai homogen. Tujuan utama sistem ini adalah untuk mengubah polaritas fase gerak. Meskipun demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang reprodusibel sangatlah sulit sehingga teknik kromatografi ini kurang begitu polpuler (Adomovic,1997).

Deteksi

Deteksi hasil pemisahan dengan KLT pada kromatogram (spot) dilakukan di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm atau penyemprotan dengan reagen tertentu seperti anisaldehida dan vanilin dalam asam sulfat. Pembentukan warna optimum pada spot bergantung pada suhu dan waktu tertentu. Suhu dan waktu optimum yang dapat digunakan untuk memunculkan warna dari spot setelah penyemprotan reagen adalah 105-110°C selama 5-10 menit (Tripathi et al. 2006).

Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi maka bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnya akan kelihatan berfluoresensi. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :

a)      Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang lempeng dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak.

b)      Mengamati lempeng di bawah lampu ultra violet yang dipasang panjang gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluoresesnsi terang pada dasar yang berfluoresensi seragam. Lempeng yang diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fluoresen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar fluoresensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluoresensi setelah dilakukan pengembangan.

c)      Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklat-kecoklatan.

d)     Memaparkan lempeng dengan uapa iodium dalam chamber tertutup.

e)      Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatat (recorder) (Mulya,1995).

DAFTAR PUSTAKA

Adnan M. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Ed ke-1. Yogyakarta: Andi.

Adamovics, J.A., 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd Edition, Marcel Dekker, New York.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill Comp.

Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publishers Limited, New York.

Mulya, M., dan Suherman, 1995, Analisis Instrumen, Airlangga University Press, Surabaya.

Patnaik Pradyot. 2004. Dean’s Analytical Chemistry Handbook. Second Edition. New York: McGraw-Hill Comp.

Rouessac Francis, Annick Rouessac. 2007. Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and Techniques. Second Edition. West Sussex: John Wiley & Sons, Ltd.

Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.

Tripathi et al. 2006. Quantitative determination of phyllanthin and hypophyllanthin in phyllanthus species by high peRformance thin layer chromatography. Phytochemical Analysis17: 394-397.

{ 1 komentar... read them below or add one }

Ria Laila Husyanti mengatakan...

Makasih yaa udah membantu tugas'ku... :)

Poskan Komentar

Daftar Blog Saya